)血清学
血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。
1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。
3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。
4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。
习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
１、凝集反应
颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutinationreaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。
１）直接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Directagglutionreaction)。
a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。
b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小时观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。
２）间接凝集反应
将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirect
agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。
２、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
１）环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。
２）絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。
３）琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。
３、补体结合反应
补体结合反应(Complementfixation
reaction)是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和溶血素）五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。
一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。各种病毒的血凝素性质不尽相同。某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：
1．生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高
压灭菌备用。
2．红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。使用前，取红细胞悬液1份，用5～10倍量的生理盐水洗涤3次，直至上清无色透明。取沉淀红细胞，加生理盐水制备成1％红细胞悬液。
3．病毒液：包括接种病料后收获的鸡胚羊水、尿囊液或感染小鼠的肺乳剂，经3000转离心沉淀15分钟，除去较大颗粒后应用。血凝抑制试验用的血凝素抗原，系用病毒接种鸡胚后收获的鸡胚尿囊液和羊水，以3000转离心20分钟，吸取上清液，加入3倍量的灭菌生理盐水，并加入1：10000硫柳汞防腐，保存于4℃冰箱备用。
4．特异性抗血清：用作阳性对照。一般用鸡制备。取血凝效价在1：320倍以上的鸡胚尿囊液，注射壮龄鸡的腹腔内，每次10毫升，共3次，每次间隔1周。最后一次注射后2周放血，分离血清，置-20℃以下冻存。血凝抑制效价可达1：640倍以上。另一法是将尿囊液静脉或腹腔注射壮龄公鸡，每次2毫升，间隔1周，如上法注射4～5次，血凝抑制效价有时可高达1：5000倍以上。按上法给壮龄公鸡静脉或腹腔注射1次尿囊液，7天后采血，也可获得血凝抑制效价有时可达1：160倍的抗血清。
5．8单位或4单位抗原的配制：以能引起红细胞100％凝集的病毒最高稀释度作为终点，即1个HA单位，终点滴度除以8即为含8HA单位的抗原。例如，如果血凝终点滴度为1：256，则8个血凝单位的稀释度应是1:32（256除以8），此例中将1ml抗原加入31ml生理盐水即为8HA单位抗原。取8HA单位的抗原加入等量生理盐水即为4HA单位抗原。
血凝素效价测定：将待检病毒液用生理盐水作1：5稀释，在大孔塑料滴定板或小试管中进行倍比稀释，直至1：2560，每孔(管)0.25毫升，最后1孔只加生理盐水作为对照。随即向各孔内加入0.25毫升的1％鸡红细胞悬液，充分混匀，于室温放置45分钟后判定结果。红细胞凝集程度以＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋和－表示。最后1孔(管)的红细胞应无凝集现象。
红细胞呈细砂粒状均匀铺于孔底者为＋＋＋＋，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整而稍向孔底集中者为＋＋＋，即75％凝集；红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块者为＋＋，即50％凝集；红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为＋，即25％凝集；红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐者为-，即无凝集。
血凝素效价以＋＋为终点，即以能够使50％红细胞凝集的血凝素的最高稀释度作为该血凝素的血凝效价。
血凝(HA)试验：在微量血凝板的1～12孔均加入25ul生理盐水。用微量移液器吸取25ul抗原加入第1孔，混匀。从第1孔吸取25ul抗原液加入第2孔，混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25ul弃之，第12孔作为生理盐水对照。每孔再加入25ul生理盐水。之后每孔均加入25ul1％鸡红细胞悬液，在微量振荡器上振荡1min，使其混合均匀；在室温(20℃～25℃)下作用40min后观察结果。红细胞凝集呈薄膜状，均匀地覆盖孔底，强凝集时凝集块皱缩呈团状或边缘呈锯齿状，即100％的红细胞凝集；红细胞凝集呈薄层，但是面积较小，孔底中央有红细胞沉积呈小圆点状，即50％的红细胞凝集；红细胞全部沉于孔底中心呈小圆点状，周围光滑，无分散的红细胞，即无凝集现象。能使红细胞100％凝集的病毒最高稀释度作为该病毒的血凝价。
血凝抑制(HI)试验：在微量反应板的第1～11孔各加入25ul生理盐水，第12孔加入50ul生理盐水。吸取25ul血清加入第1孔内，充分混匀后吸25ul于第2孔，依次对倍释至第10孔，从第10孔吸取25ul弃去。1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25ul，室温(约20℃)静置至少30min。每孔加入25ul1％的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min(室温约20℃)，若环境温度太高可置4℃条件下进行，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2㏒2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3㏒2判定HI试验阴性；HI价等于4㏒2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于5㏒2为阳性。
琼脂扩散试验，又称免疫扩散反应或凝胶沉淀反应，基本原理是可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合形成肉眼可见的线状沉淀物的一种免疫血清学技术。
琼脂凝胶的含水量极大，常用琼脂凝胶(1％～1.2％)含水98％以上，可使分子量20万以下的大分子物质自由通过。由于大多数抗原和抗体的分子量都在20万以下，所以能在琼脂凝胶中自由扩散。当抗原和抗体相应且比例适当，两者相遇就会出现一条沉淀线。一对抗原和抗体，形成一条沉淀线，故可应用琼脂扩散试验鉴定抗原和抗体成分、抗体的纯度、抗原或抗体的相对效价等。
接触和扩散于其中者，称为单相扩散，也称辐射扩散或环状沉淀试验；使抗原和抗体双方同时在琼脂凝胶中扩散而相遇成线者，称为双向扩散。由于琼脂扩散试验的操作简便，不需要特殊设备，且有较好的特异性和检出率，故已成为一种广泛应用的免疫学技术。在动物病毒学中广泛用于检测病毒抗原和毒型鉴定。应当指出，由于家禽免疫球蛋白的特殊性，琼脂凝胶中的NaCl含量应为8％，而不是通常的0.85％，使用这样的浓度可取得更好的结果。
1.操作方法
(1)抗原及抗体分别加入相应孔中，每孔加入50ul。
(2)加好的板放入湿盒中加盖后置37℃温箱中24小时观察结果。
2.判定
(1)强阳性(＋＋＋)：在被检血清孔与抗原孔之间有明显的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相连接者。
(2)阳性(＋＋)：在被检血清孔与抗原孔之间有较弱的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相连接者。
(3)弱阳性(＋)：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向被检血清孔内侧弯曲者。
(4)疑似(±)：标准阳性血清孔与抗原孔之间出现的沉淀线末端向被检血清孔内侧偏弯或微弯者。
(5)阴性(－)：被检血清孔与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清的沉淀线向相邻的被检血清孔直伸或向外侧偏弯者，判定为阴性。被检血清孔与抗原孔间出现的沉淀线与标准阳性血清的沉淀线呈现交叉现象时，为非特异反应，判为阴性。
3．注意事项
(1)琼脂质量影响试验结果，一般应用精制琼脂粉或琼脂糖配制琼脂凝胶板。
(2)孔径大、孔距小，较易出现沉淀线，但孔距太小，不易鉴别两条以上的沉淀线，故在病毒抗原分析时，孔距不宜太小。
(3)一般认为37℃感作比较容易出沉淀线，但对易于失效的病毒抗原，可置室温或4℃感作。
(4)抗原、抗体的浓度越高，出现沉淀线的时间越快，故必要时，可将抗原、抗体先作适当的浓缩处理。
4．染色
为提高沉淀线的可见度，或需长期保存标本时，可按下述方法处理标本并染色。
(1)漂洗：将琼脂板用绸布包裹后，浸泡于生理盐水中12小时，其间换液2～3次，再以蒸馏水浸泡5～6小时，其间换液2次，借以除去未结合的蛋白质。
(2)固定：解开绸布，将琼脂板浸入70％酒精配制的2％醋酸溶液中固定1小时。
(3)染色：首先配制醋酸-甲醇液，即取10ml冰醋酸、20ml水和70ml甲醇混合。再取氨基黑10B0.1g溶于100ml醋酸-甲醇液中，即为氨基黑染色液。
将固定好的琼脂扩散板浸泡于氨基黑染色液中10分钟，再用醋酸-甲醇液洗去底色，干燥后即可长期保存。
1.分类和操作原理
酶联免疫吸附试验或称酶联免疫吸附测定法(Enzyme—Linkedimmunosorbentassay，ELISA)。是当前应用最广泛的一种测定方法，它是以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行，免疫酶测定试验包括间接法、双抗体夹心法和竞争法以及近年来发展的一些改良法。
(1)间接法：将已知抗原吸附(或称包被)于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗除未起反应的物质，加入酶标抗体同种球蛋白(如被检血清是兔血清，就需用抗兔球蛋白)，感作后再经洗涤，加入酶底物，底物被分解，出现颜色变化，颜色变化的速度及程度，与样品中的抗体量有关，即样品含有抗体愈多，颜色出现得也愈快、愈深。
(2)双抗体夹心法：是检测抗原的方法，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗体在固相表面上形成复合物。洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后漂洗，加入酶底物，颜色的改变与待测样品中的抗原量成正比。
(3)竞争法：利用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量抗体的原理，测定样品中的抗原。操作时需要有只加酶标记抗原的系统作为对照。将抗体吸附于固相载体表面，感作后漂洗，加入待检抗原样品和酶标记抗原(也可先加待检样品，稍后再加酶标记抗原)。对照则只加酶标记抗原。感作后漂洗加入酶底物溶液。含酶标记抗原的对照系统出现颜色反应。而在待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制颜色反应。待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，所形成的不带酶的抗原抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，从而使酶催化底物时产生有色产物的量也减少，而带酶复合物量却相对增多，酶催化底物时产生有色产物的量也增多。因此，待检系统中颜色变化的程度与其中抗原的含量成负相关。
此外，免疫酶染色法中抗酶染色法的免疫球蛋白桥法和PAP法等也都可以用于酶联免疫吸附测定，除以上这些基本方法之外，科学工作者又在此基础上，通过“技术杂交”设计出了许多改良方法，举例如下：
阻断ELISA：将已知抗原包被于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入被检血清，感作后洗去未起反应的物质，加入抗已知抗原的酶标抗体。感作后再洗涤，加入酶底物，底物颜色变化的速度与程度，与被检血清中的抗体量有关，样品中含有的抗体愈多，与固相载体上抗原结合得愈多，剩下给已知抗体结合的位点愈少，颜色出现的愈慢、愈浅。
夹心间接ELISA：本法主要应用酶标记抗抗体测定抗原。先将特异性抗体(如兔IgG)吸附于固相载体表面，孵育后冲洗，随后加入待检抗原样品，感作后冲洗。再加入不同种动物(如豚鼠)的相同的特异性抗体。感作冲洗后，加入酶标记抗第二种抗体的动物球蛋白(如兔抗豚鼠免疫球蛋白)。再行感作冲洗后，加入酶的底物。其所产生的颜色变化与第二步中加入的抗原量成正相关。由于预先吸附在固相载体表面的抗体能够特异性地捕捉标本中的抗原，所以，这种方法又称为抗原捕捉ELISA(AC—ELISA)。
抗体捕捉ELISA：主要应用于IgM的检测。它可以解决由于IgM在液体中含量较低，用常规间接法测定常不能获得满意效果的问题。抗体捕获ELISA的操作原理是：首先用抗u链抗体(最好是单抗)包被载体，随后加入待检体液(血清或脑脊髓液等)，感作后冲洗，再加入酶标抗原或抗原～酶标抗体复合物，再行感作冲洗后，加入酶的底物。反应产生的颜色变化与体液中的特异性IgM含量成正比。
一步法ELISA：本法是双抗体夹心法的拓展，其基础是分别使用针对不同抗原决定簇的单克隆抗体包被载体和进行酶标记。具体方法是用针对待检抗原不同抗原决定簇的一种或几种单克隆抗体包被载体，包被完毕的载体经适当处理可长期保存或作商品供应。检测时，同时加入被检标本和酶标记的针对待检抗原的另一种或几种抗原决定簇的单克隆抗体，感作后冲洗，再加入酶作用的底物，反应所产生的颜色变化与待检抗原的含量成正比。本法由于待检抗原和酶标抗体同时一步加入，故称一步法，其优点是操作十分快捷，一般可在1小时内得出结果，某些商品化的一步法ELISA系统，整个检测只需几分钟。
2.ELISA的操作要领
(1)固相载体的选择：目前广泛应用的固相载体是聚苯乙烯微量反应板，有的供应商还把聚苯乙烯制成条或小杯，可随意组合应用。另一种广泛应用的固相载体是PVC塑料软板。这些材料的吸附效果与塑料的类型、表面性质有关，生产加工工艺的不同以及其他选择性能好的固相载体。吸附性能可用以下方法测定：在固相载体的每一个小孔中，加入同一份同一稀释度的抗原或抗体，使之吸附于小孔表面，然后按常规方法操作，加底物显色后测定每一孔中溶液的A值。一般认为，每两空的A值误差均在±10％内，否则不可使用。
固相载体用标准阴、阳性抗体或抗原孔的光密度差值要大，二者相差10倍以上属合格。
近年来，还有一些研究人员应用硝酸纤维素膜作为ELISA的载体，直接在膜上点样，进行一系列的操作，结果表明这种载体使用方便，敏感性、特异性等并不亚于用塑料作载体的ELISA试验，由此衍生出了斑点—ELISA(Dot—ELISA)。还有人用疏水聚酯布作为ELISA载体，使ELISA结果更易保存，由此衍生出了布—ELISA(C—ELISA)。
(2)预备试验：在正式进行ELISA试验前，必须进行预试验以确定酶结合物，包被抗原或抗体的最适浓度、底物的最适反应时间等。
酶结合物的确定：以pH9.6的碳酸盐缓冲液将IgG稀释至100ug／ml，加入固相载体的每一孔中进行包被，洗涤后将酶结合物以1：200、1：400、1：800、……作系列稀释，依次加入各孔，每一稀释度加2孔。反应完毕后加底物显色，读取结果，以能产生光吸收值(A)为1.0的稀释度为结合物的最适浓度。
包被蛋白质浓度的确定：酶结合物浓度确定后，应测定包被蛋白质(抗体或抗原)的最适浓度。其步骤是：将欲被包被的蛋白质用pH9.6的碳酸盐缓冲液作1：10、1：20、1：40……系列稀释，以每一稀释度包被固相载体的2个孔，然后进行常规的ELISA操作。最后读取结果，同样以能产生光吸收值(A)为1.0的稀释度为包被蛋白质的最适浓度。
底物最适作用时间的确定：以最适稀释度抗原和酶结合物进行试验，加入底物后在不同时间终止反应，即可确定最适反应时间。
(3)包被：将蛋白质(抗原或抗体)吸附于固相载体表面的过程称为包被。除应注意选择合适的载体(见前述)外，还应注意：
包被液的pH：通常用pH9.5～9.6，0.05mol／L或0.1mol／L的碳酸盐缓冲液稀释抗原或抗体，吸附时的pH一般为9.0左右。如pH较低，则吸附时间延长，但pH低于6.0则非特异性吸附增加。
吸附时间与温度：一般为4℃过夜，有时也可采用37℃吸附1～5小时。
蛋白质液：在固相载体上，每孔加入量一般为0.1～100ug／ml。若浓度太高，会因抗原或抗体蛋白分子之间的相互作用较大而影响载体对蛋白质的吸附；如浓度太低，则敏感性下降。
对于细胞培养产生的病毒抗原，或其他高浓度抗原，也可试用下述方法进行包被，将细胞培养物或其他抗原液加入反应板的各孔后，每孔滴入1滴20％～25％的甲醛溶液，室温固定15分钟，其间不断温和地晃动。最后用洗涤液或蒸馏水洗涤除去甲醛，包被即告完成，该法简便省时，包被效果确实。
(4)洗涤：在ELISA试验过程中，与免疫酶染色法一样，为了除去前一步所加的未结合的抗原、抗体或结合物，防止其与随后加入的相应物质或底物产生不应有的反应，则每一步都必须进行洗涤(清洗)。其方法是，先将载体各孔甩干，再加洗涤液充满各孔，静置3～5分钟，如此重复三次。然后将载体甩干，立即加入下一步的试剂。
目前较多使用的洗涤液是含有0.05％吐温-20，0.01mol／LpH7.4的PBS。应用含有0.05％吐温-20，0.01mol／LpH7.4的Tris—HCl效果也很好。
(5)封闭：抗原或抗体包被后，载体表面仍可能遗留有未吸附蛋白质的空白位点，从而造成下一步的非特异性吸附，即使用较高浓度的蛋白质包被，也有必要对包被后的载体进行处理，以封闭可能存在的空白位点。常用的封闭液有：1％～3％牛血清白蛋白、3％～5％脱脂乳、10％牛或马血清等。加入封闭液后，可在37℃吸附2小时，然后洗涤。
(6)结果判定：ELISA结果的判定方法很多，常用的有以下几种：
目视比色法：在ELISA试验完成后，直接以肉眼观察反应产物的颜色变化，作出阴性或阳性的判断。这种方法主要用于ELISA的定性实验中。
光电比色法：用分光光度计在适宜的波长下测定反应后的光密度值，然后以下列方法之一对样品进行定性或定量：
a．绝对值法：在小心控制的条件下，结果以绝对值来表示。在抗体测定中，先确定未感染群体的绝对值平均值(X)，然后在此水平上选择一个指示感染值(一般是X±2SD或X±3SD)，如果被检血清的值在该值之上，为阳性；在其下，为阴性。
b．P／N比法：即被检样品(P)的光吸收值(A)和阴性标准样品(N)平均(A)值之比，以大于某一比值(一般为≥2)为阳性。
c．终点法：所有血清通过连续稀释滴定，并测定每一稀释度的A值，根据阴性血清的测定结果，选定一个绝对值(见绝对值法)，以产生这个绝对值的稀释倍数作为“效价”。
d．单稀释法：被检样品不作连续稀释，而根据预试验的结果选择一个合适的稀释度。所有样品都按该稀释度稀释，反应后测定光吸收值，将此值与用标准样品作成的标准曲线比较，或用回归方程计算，得出被检样品的“效价”。有人将这种方法称为单稀释ELISA。
(1)应用间接ELISA检测牛白血病抗体(定性)：以持续感染牛白血病病毒的胎羊肾细胞培养物作为制备病毒抗原的材料。收获细胞培养液320ml，于4℃以2000g离心沉淀15分钟，取上清液。随后再于4℃以80000g离心沉淀2小时。将沉淀病毒重新悬浮于内含0.15mol／L、pH7.2的0.01mol／L磷酸盐缓冲液内，并以PBS稀释至6ml。层加于5ml20％蔗糖(W／W)PBS柱上，以110000g于4℃离心沉淀2小时，将沉淀病毒重新悬浮于3.2mlPBS，总共浓缩100倍。经鉴定合格后，分装小瓶，-70℃保存备用。
以包被液将抗原稀释50倍，随后滴加于微量滴定板的孔内，每孔200ul。4℃感作过夜。用洗涤液泡洗5次，随后加入以0.01mol／L、pH7.4的PBS(内含0.5mol／L氯化钠和0.05％吐温-20)作1：5稀释的被检血清，每份血清加3个孔，每孔200ul，37℃感作3小时，如上泡洗4次，再加1：1000稀释的酶标记兔抗牛IgG200ul，37℃感作1小时，如上泡洗4次，最后加5-氨基水杨酸底物溶液，每孔200ul。室温感作15分钟后，加入50ul1％NaN3终止反应后进行判定。另设阳性血清和阴性血清对照。以P／N≥1.5作为阳性判定标准。
(2)应用夹心ELISA测定粪便标本中的牛病毒性腹泻～粘膜病病毒(BVDV)：王新平等应用牛病毒性腹泻～粘膜病病毒高免血清提取IgG，以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1mg／ml，滴加于聚苯乙烯的滴定板的孔内，每孔100ul，于4℃包被过夜，并用5％兔血清的PBS(pH7.4，内含0.05％吐温-20)37℃封闭1小时，然后用洗涤液(pH7.4PBS，内含0.05％吐温-20)泡洗3次，每次3分钟，甩干后加入1：10稀释的待检粪样，每孔100ul，37℃感作2小时，再以上述洗涤液泡洗3次，随后加入1：400稀释的抗BVDV酶标抗体100ul，37℃感作2小时，如上泡洗3次以。最后加邻苯二胺，(OPD)—H2O2底物溶液100ul，室温感作30分钟，再加50ul2mol／L硫酸终止反应。目测或以分光光度计测定492nm波长的A492值，进行判定。以P／N≥2为阳性。按常规，设置阴、阳性对照，如上述。
(3)单稀释ELISA检测鸡传染性喉气管炎抗体：毛春生等以鸡胚皮肤细胞培养的鸡传染性喉气管炎病毒为抗原包被聚苯乙烯反应板，然后加入1：80稀释的待检血清，感作洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，再感作洗涤后，加OPD—H2O2底物，在37℃条件下反应30分，以2mol／L硫酸终止反应，读取光吸收值。实验结果表明，血清单稀释度(1：80)的光吸收值(A值)与终点法所测定的ELISA滴度(ET)的自然对数间呈良好的线性关系：1n(ET)＝5.80A＋3.96(r=0.94＞r0.01)，单稀释法比终点法可提高实验效率8～10倍。
(4)单克隆抗体ELISA抑制法检测细胞培养物中的猪瘟兔化弱毒：房德兴等首先将猪瘟兔化弱毒抗原包被40孔酶联反应板，再加入不同稀释度猪瘟兔化弱毒细胞培养物与等量1：1000稀释的酶标抗猪瘟单克隆抗体混合物，37℃作用45分钟后洗涤，最后加入OPD—H2O2底物溶液。用硫酸终止反应后测定A值，按以下公式计算抑制率，并以Reed—Muench法计算50％抑制价。抑制价＝空白孔A—待检孔A值×100％空白孔A值
(5)斑点—ELISA(Dot—ELISA)检测狂犬病病毒：李金中等为检测狂犬病病毒，建立了夹心间接Dot—ELISA，其操作步骤为：①用铅笔在硝酸纤维素膜(NC)的光滑面分成0.5cm×0.5cm的小格；②用碳酸盐缓冲液将仓鼠抗狂犬病病毒IgG抗体稀释至50ug／ml，每格点样2ul，室温晾干；③以0.01mol／LPBS、1％吐温-20、5％小牛血清(pH7.4)的封闭液在37℃下作用30分钟，洗涤(每次泡洗3分钟，共3次，下同)晾干备用。④用小滤纸片分别蘸取阴性、阳性和待检抗原置每一小格内，37℃感作30分钟，洗涤。⑤将兔抗狂犬病病毒IgG(第一抗)用封闭液稀释至25ug／ml，倒入含有反应膜的平皿中，37℃感作30分钟，洗涤；⑥用封闭液将驴抗兔酶标抗体(第二抗)稀释1000倍，倒入含有反应膜的平皿中，37℃感作30分钟，洗涤；⑦用pH7.6的Tris—HCl缓冲液将DAB稀释至0.5mg／ml，室温显色10分钟后，判定结果。与背景颜色一致判为阴性，具有肉眼可见的棕色斑点判为阳性。实验结果表明，夹心间接Dot—ELISA、夹心间接ELISA和小鼠脑内间接种三种方法可以相互替代，其中以夹心间接Dot—ELISA最为简便。
