)花菜豆酸
一、脱落酸的发现和性质(一)脱落酸的发现 脱落酸(abscisicacid，ABA)是指能引起芽休眠、叶子脱落和抑制生长等生理作用的植物激素。它是人们在研究植物体内与休眠、脱落和种子萌发等生理过程有关的生长抑制物质时发现的。 1961年刘(W.C.liu)等在研究棉花幼铃的脱落时，从成熟的干棉壳中分离纯化出了促进脱落的物质，并命名这种物质为脱落素(后来阿迪柯特将其称为脱落素Ⅰ)。1963年大熊和彦和阿迪柯特(K.OhkumaandF.T.Addicott)等从225kg4～7天龄的鲜棉铃中分离纯化出了9mg具有高度活性的促进脱落的物质，命名为脱落素Ⅱ(abscisinⅡ)。 在阿迪柯特领导的小组研究棉铃脱落的同时，英国的韦尔林和康福思)领导的小组正在进行着木本植物休眠的研究。几乎就在脱落素Ⅱ发现的同时，伊格尔斯(C.F.Eagles)和韦尔林从桦树叶中提取出了一种能抑制生长并诱导旺盛生长的枝条进入休眠的物质，他们将其命名为休眠素(dormin)。1965年康福思等从28kg秋天的干槭树叶中得到了260μg的休眠素纯结晶，通过与脱落素Ⅱ的分子量、红外光谱和熔点等的比较鉴定，确定休眠素和脱落素Ⅱ是同一物质。1967年在渥太华召开的第六届国际生长物质会议上，这种生长调节物质正式被定名为脱落酸。（二）ABA的结构特点 ABA是以异戊二烯为基本单位的倍半萜羧酸(图7-19)，化学名称为5-(1′-羟基2′，6′，6′-三甲基-4′-氧代-2′-环己烯-1′-基)-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸〔5-(1′-hydroxy-2′,6′,6′-trimethyl-4′-oxo-2′-cyclohexen-1′-yl)-3-methyl-2-cis-4-trans-pentadienoicacid〕，分子式为C15H20O4，分子量为264.3。ABA环1′位上为不对称碳原子，故有两种旋光异构体。植物体内的天然形式主要为右旋ABA即(+)-ABA，又写作(S)-ABA。(三)ABA的分布与运输 脱落酸存在于全部维管植物中，包括被子植物、裸子植物和蕨类植物。苔类和藻类植物中含有一种化学性质与脱落酸相近的生长抑制剂，称为半月苔酸(lunlaricacid)，此外，在某些苔藓和藻类中也发现存在有ABA。 高等植物各器官和组织中都有脱落酸，其中以将要脱落或进入休眠的器官和组织中较多，在逆境条件下ABA含量会迅速增多。水生植物的ABA含量很低，一般为3～5μg·kg-1；陆生植物含量高些，温带谷类作物通常含50～500μg·kg-1，鳄梨的中果皮与团花种子含量高达10mg·kg-1与11.7mg·kg-1。 脱落酸运输不具有极性。在菜豆叶柄切段中，14C-脱落酸向基运输的速度是向顶运输速度的2倍～3倍。脱落酸主要以游离型的形式运输，也有部分以脱落酸糖苷的形式运输。脱落酸在植物体的运输速度很快，在茎或叶柄中的运输速率大约是20mm·h-1。二、脱落酸的代谢 脱落酸的合成部位主要是根冠和萎蔫的叶片，茎、种子、花和果等器官也有合成脱落酸的能力。例如，在菠菜叶肉细胞的细胞质中能合成脱落酸，然后将其运送到细胞各处。脱落酸是弱酸，而叶绿体的基质呈高pH，所以脱落酸以离子化状态大量积累在叶绿体中。(一)ABA的生物合成脱落酸生物合成的途径主要有两条：1.类萜途径(terpenoidpathway)脱落酸的合成是由甲瓦龙酸(MVA)经过法呢基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)，再经过一些未明的过程而形成脱落酸。此途径亦称为C15直接途径。MVA→→FPP→→ABA2.类胡萝卜素途径(carotenoidpathway)脱落酸的碳骨架与一些类胡萝卜素的末端部分相似。塔勒(Tarlor)等将类胡萝卜素曝露在光下，会产生生长抑制物。后来发现紫黄质(violaxanthin)在光下产生的抑制剂是2顺式黄质醛(xanthoxin)，在一些植物的枝叶中也检出这种物质。黄质醛迅速代谢成为脱落酸。近几年发现，除了紫黄质外，其他类胡萝卜素(如新黄质neoxanthix，叶黄素lutein等)都可光解或在脂氧合酶(lipoxygenase)作用下，转变为黄质醛，最终形成脱落酸(图7-20)。由类胡萝卜素氧化分解生成ABA的途径称为ABA合成的间接途径。通常认为在高等植物中，主要以间接途径合成ABA。直接途径是指从C15化合物(FPP)直接合成ABA的过程。间接途径则是指从C40化合物经氧化分解生成ABA的过程。(SuzukiMasaharu,1998)(二)ABA的钝化ABA可与细胞内的单糖或氨基酸以共价键结合而失去活性。结合态的ABA可水解重新释放出ABA。因而结合态ABA是ABA的贮藏形式。但干旱所造成的ABA迅速增加并不是来自于结合态ABA的水解，而是重新合成的。(三)ABA的氧化ABA的氧化产物是红花菜豆酸(phaseicacid)和二氢红花菜豆酸(dihydrophaseiacid)。红花菜豆酸的活性极低，而二氢红花菜豆酸无生理活性。三、脱落酸的生理效应(一)促进休眠 外用ABA时，可使旺盛生长的枝条停止生长而进入休眠，这是它最初也被称为"休眠素"的原因。在秋天的短日条件下，叶中甲瓦龙酸合成GA的量减少，而合成的ABA量不断增加，使芽进入休眠状态以便越冬。种子休眠与种子中存在脱落酸有关，如桃、蔷薇的休眠种子的外种皮中存在脱落酸，所以只有通过层积处理，脱落酸水平降低后，种子才能正常发芽。(二)促进气孔关闭 ABA可引起气孔关闭，降低蒸腾，这是ABA最重要的生理效应之一。科尼什(K.Cornish,1986)发现水分胁迫下叶片保卫细胞中的ABA含量是正常水分条件下含量的18倍。ABA促使气孔关闭的原因是它使保卫细胞中的K+外渗，从而使保卫细胞的水势高于周围细胞的水势而失水。ABA还能促进根系的吸水与溢泌速率，增加其向地上部的供水量，因此ABA是植物体内调节蒸腾的激素，也可作为抗蒸腾剂使用。(三)抑制生长 ABA能抑制整株植物或离体器官的生长，也能抑制种子的萌发。ABA的抑制效应比植物体内的另一类天然抑制剂--酚要高千倍。酚类物质是通过毒害发挥其抑制效应的，是不可逆的，而ABA的抑制效应则是可逆的，一旦去除ABA，枝条的生长或种子的萌发又会立即开始。(四)促进脱落 ABA是在研究棉花幼铃脱落时发现的。ABA促进器官脱落主要是促进了离层的形成。将ABA涂抹于去除叶片的棉花外植体叶柄切口上，几天后叶柄就开始脱落(图7-21)，此效应十分明显，已被用于脱落酸的生物检定。(五)增加抗逆性 一般来说，干旱、寒冷、高温、盐渍和水涝等逆境都能使植物体内ABA迅速增加，同时抗逆性增强。如ABA可显著降低高温对叶绿体超微结构的破坏，增加叶绿体的热稳定性；ABA可诱导某些酶的重新合成而增加植物的抗冷性、抗涝性和抗盐性。因此，ABA被称为应激激素或胁迫激素(stresshormone)。
【摘要】目的研究小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱。方法色谱柱为大连依立特ODSC18（250mm×4.6mm,5μm）；以90%甲醇-水-0.2%H3PO4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流动相B，按一定比例配制，梯度洗脱；柱温为31℃；流速为1mL/min；检测波长为275.5nm；分析时间为120min。结果初步建立了小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱，标定了19个共有指纹峰，并对7个共有指纹峰进行了标记。结论该法建立的指纹图谱具有可靠性，可为进一步研究小叶榕叶水提物的质量标准提供依据。
【关键词】小叶榕叶;指纹图谱；高效液相色谱法
基金项目：广东省中医药局2005年资助项目（1050044）
HPLCfingerprintsoftheextractsofFoliumficimicrocarpae
LAIYi-qin,LIUFeng,ZHOUHong-bin,CHENJia-lin
(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,GuangdongCollegeofPharmacy,Guangzhou,Guangdong510006,China;GuangzhouBaiyunshanPharmaceuticalGeneralFactory,Guangzhou,Guangdong510515,China)
Abstract:ObjectiveTodeterminetheHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae.MethodsTheextractswasanalyzedonanODSC18column(4.6mm×250mm,5μｍ)using90%methanol-water-0.2%H3PO4asgradienteluteA，20%tetrahydrofuran-water-0.2%H3PO4asgradienteluteB.Theflowratewas1mL/minandcolumntemperature31℃.Thedetectionwavelengthwas275.5nm.ResultsHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpaewasestablished.Atotalof19commonpeakshavebeenidentifiedand7compoundswhichwereseparatedfromleavescouldbefoundtherelativepeaksinchart.ConclusionThefingerprintsarereliable,whichcouldbeusedforqualitycontroloftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae..
Keywords:Foliumficimicrocarpae;fingerprints；HPLC
小叶榕叶是桑科植物榕属小叶榕FicusmicrocarpaL.f.的干燥叶子，主要产于广东和广西［1］。小叶榕叶水提物浸膏作为咳特灵的主成分收载在部颁标准［2］中，用于治疗哮喘和慢性支气管炎。目前的部颁标准，只对小叶榕叶水提物浸膏做了薄层鉴别，质量标准较简单。本文对小叶榕叶水提物浸膏进行了HPLC指纹图谱的研究，为进一步研究和制订小叶榕叶及其提取物HPLC指纹图谱奠定实验依据。
1仪器与试药
1.1仪器
福立2000高效液相色谱仪:N2000色谱工作站，二元泵，柱温箱，紫外检测器。
1.2试剂
试剂均为色谱纯，并用0.45μm微孔滤膜过滤。
1.3对照品
苯甲酸、1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮、2-羟基苯甲酸、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、红花菜豆酸、4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸，均为作者从小叶榕叶水提物中分离得到的化合物，并经IR、EI-MS、NMR鉴定结构，纯度经HPLC检测大于98.5%。
1.4药材
小叶榕叶水提物浸膏，白云山制药厂提供。
2方法与结果
2.1供试品溶液的制备
取小叶榕叶水提物浸膏约1g，蒸馏水溶解后，乙醇醇沉使溶液醇浓度为50%［3］，滤除不溶物，挥除乙醇直至没有醇味，得滤液。滤液用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次［2］，得乙酸乙酯层浸膏。将乙酸乙酯层浸膏用适量的甲醇溶解，定容至10mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2对照品溶液的制备
取各对照品适量，甲醇溶解后，定容至1mL，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.3检测波长的选择
取按“2.1”项方法制备的供试液进行紫外扫描，所得图谱见图1。从图1可见，275.5nm处有最大吸收峰，故确定275.5nm为检测波长。
图1小叶榕叶供试液的紫外扫描图（略）
Fig.1UVchromatogramoftheaqueousextractofFoliumficimicrocarpae
2.4色谱条件
色谱柱为大连依立特ODSC18（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：以90%甲醇-水-0.2%H3PO4为流动相A，以20%四氢呋喃-水-0.2%H3PO4为流动相B，按表1比例配制进行梯度洗脱；柱温为31℃；流速为1mL/min；检测波长为275.5nm；分析时间为120min；进样量为20μL。
表1梯度洗脱表（略）
Tab.1Gradientelutiontime
2.5方法学考察
2.5.1空白试验吸取溶剂20μL，按“2.4”项条件进样测定，记录色图谱，结果见图2。从图2可见，溶剂对测定无干扰。
图2空白试验（略）
Fig2HPLCchromatogramoftheblankassay
2.5.2精密度试验取同一份供试品溶液，连续进样5次，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1min内，RSD在0.2%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.7%～2.7%之间，表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均符合指纹图谱检测要求［4］。
2.5.3稳定性试验取同一份供试液，分别在0、2、4、6、24h进样测定，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1min内，RSD在0.3%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在0.8%～2.9%之间。表明供试液在24h内稳定，符合指纹图谱检测要求［4］。
2.5.4重现性试验取同一批小叶榕叶水提物浸膏，按“2.1”下制备5份供试液，分别进样测定，比较共有峰的相对保留时间及峰面积比值。结果各共有峰的相对保留时间在均值±1min内，RSD在0.3%～0.8%之间，各共有峰的峰面积比值的RSD在1.2%～2.8%之间，表明共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD符合指纹图谱检测要求［4,5］。
2.6指纹图谱及技术参数
2.6.1共有指纹峰的标定取3批小叶榕叶水提物浸膏，对其HPLC指纹图谱做初步考察，初步确定了19个分离度较好且峰面积稳定的峰为共有峰。结果见图3。
图3小叶榕叶提取物浸膏的指纹图谱（略）
Fig.3HPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae
2.6.2共有指纹峰的相对保留时间根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，确定平均保留时间为44.643min的8号共有峰为内标参照峰，其余18个共有指纹峰与参照峰相比，相对保留时间依次为：0.1283、0.1459、0.1610、0.2628、0.3947、0.4878、0.7581、1.1026、1.3346、1.6920、1.7398、1.8135、1.8807、1.8946、2.0636、2.0788、2.1154、2.1421。
2.6.3共有指纹峰的相对峰面积根据初步研究，共有峰面积占总峰面积比值为66.310%～80.094%。保留时间小于30min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10％而小于20％的共有峰为5号，其相对峰面积比值为0.9102～0.9717，差值小于±25％。保留时间超过30min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于10％而小于20％的共有峰为7号和8号，7号峰的相对峰面积比值为0.5915～0.6725，其差值小于±25％。结果符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。
2.7部分共有峰的标记
取各对照品溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，HPLC色谱图见图3。结果确认了以下7个共有峰：11号峰为苯甲酸（75.332min），12号峰为1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮（77.298min），7号峰为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸（32.865min），内标参照峰为4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸（43.832min），6号峰为4-羟基苯甲酸（21.232min），16号峰为红花菜豆酸（91.398min），5号峰为4-甲氧基-3,5-二羟基苯甲酸（17.165min）。
3讨论
3.1目前国内文献中，一般都以总黄酮作为咳特灵中小叶榕叶水提物的质量指标，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法［3］，或以槲皮素为对照品，用紫外分光光度法在265nm处［5］测定其总黄酮含量。但作者从小叶榕叶分离得到的7个化合物，通过HPLC检测均为含量较大的共有峰，均不是黄酮类化合物。另外，文献［6～8］报道，在小叶榕叶中甲醇提取物中分离出的42个化合物中也仅有3个黄酮类化合物。Al(NO3)3-NaNO2-NaOH的黄酮专属性不强，一些具有邻二酚羟基的非黄酮物质也会发生反应［8］。分别称量对照品1至7，每个化合物约0.0003g。将这7个化合物混合后，用甲醇溶解，定容至10mL。取少量混合液作为空白对照进行紫外扫描，结果见图4。吸取6mL混合液置25mL的容量瓶中，加1mL质量分数为5%的NaNO2，摇匀,放置6min，再加1mL质量分数10%的Al(NO3)3，摇匀,放置6min，最后加1mL质量分数4%的NaOH，加水至刻度,摇匀。加入NaOH后观察到溶液从透明无色变为黄色。在15min内对反应液进行紫外扫描，结果见图5。两图比较,反应后的溶液在500nm处有明显吸收,而反应前的空白液在500nm处则无吸收。说明从小叶榕叶中分离得到的化合物，混合后也能发生Al(NO3)3-NaNO2-NaOH反应。综上所述，作者认为以总黄酮作为小叶榕叶水提物浸膏的质量指标，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法进行测定的方法是否合理，值得进一步探讨，建立其HPLC指纹图谱可能更科学。
图4空白对照紫外扫描图（略）
Fig.4UVchromatogramofblankassay
图5反应后紫外扫描图（略）
Fig.5UVchromatogramofreaction
3.2由于条件和时间限制，本文只对3批小叶榕叶水提物浸膏的HPLC指纹图谱做了初步研究，共有峰面积占总峰面积的平均比值为73.247%，暂未达到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中非共有峰总面积不得大于总峰面积10％的要求。今后将收集不同产地的小叶榕叶作进一步的研究。
【参考文献】
［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社,2001:2528-2529.
［2］中华人民共和国卫生部.WS3-B-2742-97咳特灵片［S］.
［3］叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究［J］.广东药学院学报，2003,19(4):330-331.
［4］蔡宝昌,刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术［M］.北京:化学工业出版社,2005:1-18,23.
［5］贾茹冰.咳特灵胶囊中小榕树膏总黄酮的含量测定［J］.广西中医学院学报,2000,17(4):65-66.
［6］林焕祐.正榕叶部之成分研究［D］.台湾大学，2003.
［7］KUOYueh-Hsiung,LINHuan-you.Twonoveltriterpenesfromtheleavesofficusmicrocarpa［J］.HelveticaChimicaActa,2004,87(5):1071-1076.
［8］郭亚健,范莉,王晓强,等.关于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002,22(2):97-98.
http://journal.shouxi.net/html/qikan/dxxb/gdyxyxb/20082261/zyytryw/20080831045108438_345503.html
