)组织化学
组织化学是指以常用的组织化学技术,对细胞内主要化学成分和活性的粗略(一般性)的研究.
概要介绍如下:
一,______核酸(DNA和RNA)
(一)__化学特性
1.分布:DNA(细胞核内)
RNA(核仁10%;细胞质-核糖体90%)
2.分子结构:戊糖+磷酸+碱基
特点:①大量的磷酸基团→酸性
(嗜碱性的基础)
②戊糖—被盐酸水解→醛基
(成为Feulgen法显示核酸的基础)
②戊糖—被盐酸水解→醛基(成为Feulgen法显示核酸的基础)
③可以完全水解或部分水解
④可以用RNAase或DNAase消化
[对照实验(—)]
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(一)__显示方法
1.福尔根(Feulgen)反应显示DNA
[原理]在60℃温度下,将DNA用1N盐酸水解,DNA双链打开成单链,先释出碱基,然后脱氧核糖释出醛基,该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀.
[Schiff试剂显色原理]
碱性品红亚硫酸→白亚黄酸
(无色试剂,称为Schiff试剂)
[方法]
固定剂的选择可用一般的组织学固定液,常
用Carnoy固定液.
Carnoy固定液:
纯酒:氯仿:冰醋酸=6:3:1
(60ml)(30ml)(10ml)
恒冷箱切片机的具体染色步骤如下:
⑴切片固定在冰醋酸与纯乙醇(1:3V/V)
中10分钟.
⑵由乙醇降至蒸馏水中.
⑶用1N盐酸浸泡.
⑷放入预热到60℃的1N盐酸中,留6分钟.
⑸放入室温的1N盐酸中.
⑹放入Schiff液试剂,保持在暗处,60分钟
⑺用新配制的SO2水浸洗3次(脱掉未反应
的Schiff液).
⑻蒸馏水浸洗净(必须用蒸馏水→洗净无色品红,
否则,残留试剂→有色品红).
⑼脱水透明,封固.
结果:核内DNA染为红紫色.
对照:仅改变第4步为1N盐酸,室温15分钟→(-).
[注意事项]
⑴不用醛类固定剂如Bouin,戊二醛,丙烯醛等.
常用Carnoy液,甲醇等.
⑵控制水解时间,不同的固定剂用不同的时间,
如:Carnoy8分钟;Genker5分钟;
Susa18分钟★最适条件应自行试验.
⑶控制温度,一般1N盐酸60℃;
如果5N盐酸18～25度.
⑷保证Schiff试剂的纯净度.
⑸SO2要新配制,除去多余的Schiff液宜用之.
⑹必须对照.
2._显示核酸的其它方法
⑴Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法
⑵甲绿派若宁Methygreen-Pyronin显示DNA和
RNA法
⑶菊花青铬明矾(GC)显示核酸法
⑷丫啶橙AcridineOrange显示DNA和RNA法
⑸核酸提取法
_一,______蛋白质(Protein)
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(一)蛋白质的分子结构
蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基酸结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:—羟基,硫氢基,二硫基等.依其结构特点可分为:酸性氨基酸和碱性氨基酸;芳香族氨基酸:苯丙氨基酸,酪氨基酸;杂环类氨基酸:组氨基酸,色氨基酸,亚氨基酸,脯氨基酸,羟脯氨基酸.
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(二)目前应用
1._用于蛋白质的一般定性
①确定是否为蛋白质
②确定蛋白质的酸碱性
③显示蛋白质的特殊基团
2._用于蛋白质功能定性和定位
_(三)染色方法
目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶
组织化学法,配体—受体结合法,免疫组化法以
显示特殊的蛋白质.这里仅介绍一般的染色方法.
1.四氮化联邻茴香胺法
(Tetra-azotized-o-anisidine)
[应用]广泛应用于显示酶的活性
[原理]芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下(<
5℃)可生成重氮盐,此即重氮反应.重氮盐可
与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物.上
述反应必须在酸性条件下进行.
本实验,联邻茴香胺在酸性,低温条件
下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个
重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所
要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结
合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈
类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成
的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量.
[方法]
1._四氮盐配制
⑴天平称取联邻茴香胺0.25g(有毒,通
风橱内进行).
⑵在冰浴下,加入已预冷8%盐酸10ml,
玻璃搅拌,促其溶解,混合后为悬浊液.
⑶称NaNO20.15g溶于1ml蒸馏水中(冰浴
下).
⑷在冰浴下,将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内,每次倒入都须玻棒搅动,因产生NO2可有黄烟冒出,至黄烟停止再倒下一次液体.放入冰箱(4℃)内,约20分钟,待溶液变为黄色.
⑸倾出上清液,勿将沉渣泛起,弃去沉渣.
⑹用NaHCO3细粉(约0.5～0.6g)逐渐加
入上清液内,边加边搅拌(冰浴下).
⑺以刚果红试纸测中和点,待试纸不变蓝即达到中和.收集于标本瓶(或广口瓶)内,置冰箱备用.此液不稳定,置冰箱内可保存两周,若变为橘红色则失效.
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2._偶氮反应
—Carnoy固定的大鼠肝,肠等石蜡切片.
⑴切片脱蜡至水.
⑵将切片放入下列溶液中(在冰浴中至2～3℃),
浸染10分钟.
用前配制:
四氮化联邻茴香胺溶液4ml
0.1巴比妥缓冲液(pH9.2)20ml
24ml
⑶入1N盐酸(冰浴中2～3℃)浸洗10秒,多余盐
酸以滤纸吸干.
⑷入H酸饱和液,浸染30分钟(冰浴或冰
箱内).
H酸饱和液配制:H酸0.4g
0.1M巴比妥缓冲液20ml
(pH9.2)过滤后使用!
⑸蒸馏水冲洗,脱水,透明,封固(树胶)
[结果]
酪氨酸,组氨酸,色氨酸染成红棕色(+)
※0.1M巴比妥钠50ml配制
①分析天平称巴比妥钠(MW=206.18)
1.0309g
②于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可.
0.1M巴比妥缓冲液,pH9.2(20ml)配
制:0.1M巴比妥钠19.1ml
0.1N盐酸0.9ml
20ml
2.其它的显示蛋白质的方法
⑴米朗反应(MillonReastion)→显示酪氨
酸的方法
酪氨酸→羟苯基亚硝酸→亚硝基苯+Hg→有色物
注:胶原蛋白不显色,其它蛋白质都显色(+)
⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene(DNFB)法
DNFB与—NH2,SH和酪氨酸产生弱有色反应,
可被偶氮染料加强.
⑶酪氨酸重氮化偶联反应
⑷蛋白质硫氢基DDD法(固定时避免
氧化剂)
⑸铁—铁氰化钾反应显示SH基
⑹高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法
⑺免疫荧光法显示蛋白质
三,碳水化合物
中性多糖——糖原
碳水化合物酸性多糖——硫酸软骨素A,B,
C,肝素,硫酸角
(组织中—多糖类)质素,透明质酸等
蛋白多糖——粘蛋白,唾酸粘蛋白
糖脂——脑苷脂类
※组织中糖的种类较多,因此,要特异性地显示各种
糖类必须用抑制和酶水解来对照实验.
本章仅以高碘酸雪夫法(PAS法)说明之,其它的
方法还有Alcianblue法,甲苯胺蓝异染性染色法等.
高碘酸雪夫法Periodic—Schiff(PAS)method
[原理]高碘酸为强氧化剂,它可以氧化多糖
分子内1,2—乙二醇(顺式和反式)而
产生醛基,此醛基再与Schiff试剂结合即
产生红紫色.
[方法]改良的McManus(1946),高碘酸雪夫法
标本:
①Carnoy固定的大白鼠肝,肾,肠石蜡切片
②大白鼠肝横冷箱切片(未固定)
[步骤]
(1)切片脱蜡入水(横冷箱切片免)
(2)入0.5%高碘酸水溶液,室温,2～5分钟
(3)蒸馏水涮洗
(4)入Schiff试剂,洗3次,每次2分钟
(5)入SO2水中,洗3次,每次2分钟
(6)自来水洗5～10分钟
(7)蒸馏水稍洗
(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟
(9)自来水5分钟,换蒸馏水
(10)脱水,透明,封固
[结果]
PAS(+)→红紫色或红色;核→蓝色
Carnoy固定,糖原原位定位不佳,有
移位现象.
[对照]
①用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟.
②苯甲酰或乙酰化法作对照(抑制法)
[注意事项]
①必须按照规定配方配制试剂,按规定的时间反应.以避免非特异反应.例如:入高碘酸水溶液时间不宜过长,否则非特异着色.
②多糖大多都易溶于水,固定时应避免扩散或移位.
冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位.
③注意溶液的pH值:高碘酸液的pH不应超过5.
④注意温度.反应宜在<25℃的室温下进行,否则可氧化醛基为羧酸.
⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%(0.02—0.1M)浓度过高则会发生非特
异反应.
⑥为充分显示多糖中的糖原,可在过碘酸
中加入5%醋酸或纯乙醇固定,但往往有
溶解和扩散.
⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应,
可使用还原液,于使用Schiff液之前.
[分析结果]PAS反应阳性物质:糖原,中
性粘蛋白,中性唾液性粘蛋白.
四,脂类
[组织中的脂类]
单纯脂类脂肪酸
醇的化合物(如:甘油三脂等)
复合脂类磷脂(卵磷脂,脑磷脂)
脂类鞘磷脂
糖脂(脑苷脂,神经苷脂)
衍生脂类胆固醇
肾上腺素
性激素
[显示脂类的基本原理]
用易溶于脂类的染料,使之溶于所检
的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.
[常用方法]
苏丹黑B法,油红O法,硫酸尼罗蓝法
[基本要求]
⑴不用石蜡切片.
⑵固定剂一般用Formalin保存磷脂较好.
⑶方法:
①物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶
氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏
丹黑,油红O等.
②化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸.
③选择性提取法(对照)
实验举例:苏丹黑B法
[原理]
苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可
溶于无水酒精,但不溶于水(常用70%酒
精饱和液).当组织切片入染液时,苏丹
黑B便离开染液而溶于组织内的脂质(如脂
滴中)使组织内脂类着色.
标本:
兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10μm厚,不
固定(或用10%Formalin固定10分钟后水洗).
[方法]
①入蒸馏水洗
②于70%乙醇内涮洗
③入苏丹黑B70%B饱和液,染5～10分钟
④于50%酒精内浸洗
⑤蒸馏水中洗
⑥入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟
⑦自来水冲洗5～10分钟
⑧入蒸馏水
⑨甘油明胶(或Apathy糖胶)封固
[结果]细胞内脂滴均呈黑色
