植物细胞

细胞是植物体结构和功能的基本单位。植物界的种类形形色色、千差万别，但就植物体的构造来说，除了低等的类型(病毒)以外，都是由细胞构成的。单细胞的低等植物，一个细胞就代表一个个体，一切生命活动，包括新陈代谢、生长、发育和繁殖，都由一个细胞来完成；复杂的高等植物，一个个体是由无数的细胞构成的，细胞之间有了机能上的分工和形态结构上的分化，它们相互依存、彼此协作，共同保证着整个有机体正常生活的进行。 组成植物体的细胞的形状和大小是各不相同的，其不同部位的细胞，形状和大小与它们行使的功能密切相关。大多数高等植物细胞的直径通常约在10-200微米之间。植物细胞的大小差异很大，一般必须在显微镜下才能看到。在种子植物中，细胞的直径一般在10～100μm之间，较大细胞的直径也不过是100～200μm。也有少数植物的细胞较大，肉眼可以分辨出来，如番茄果肉、西瓜瓤的细胞，直径可达1mm；苎麻茎中的纤维细胞，最长可达550mm；有的细胞极长，如苎麻纤维细胞可长达55cm，最长的细胞十无节乳汁管长达数米至数十米，如橡胶树的乳汁管，但这些细胞在横向直径上仍是很小的。植物细胞的大小是由遗传因素所控制，其中主要是由于细胞核的作用。

一般说来，具有同样功能的细胞，它们的大小可由下述因素所控制：①细胞核控制能力的限制。细胞核与细胞质一起进行着细胞中的生长、发育和保持细胞的正常代谢活动，细胞核对于细胞质的影响，在数量上有一定的限制，细胞的大小就受细胞核所能控制范围的制约。②细胞表面积的限制。生活细胞中，原生质不断地进行着一切代谢活动，并与周围环境(包括相邻的细胞)不断地进行物质交换；同时，进入细胞的物质，在内部也有一个扩散传递问题。细胞体积小，它的相对表面积就大，这对物质的迅速交换和转运都比较有利。此外，细胞的大小受细胞内代谢速率的影响。在自然界中，可以看到，代谢速率快的植物细胞一般都比较小，而较大的细胞活动相对较少。例如，根、茎顶端的分生组织细胞就比储藏的薄壁组织细胞要小得多。

植物细胞的形状非常多样，常见的有球形、椭圆形、多面体、纺缍形和柱状体等。植物细胞的形状大小尽管多种多样，但基本结构是一样的。例如一切活细胞都含有原生质和其外面的细胞壁。坚硬的细胞壁保护着原生质体，并且维持着细胞的一定形状，其主要成分是纤维素。细胞壁是植物细胞独有的，动物细胞没有细胞壁。植物细胞还含有质体，是植物细胞生产和储存营养物质的场所。最常见的质体是叶绿体，它是专门进行光合作用的细胞器。动物细胞中不含有质体。大多数植物细胞都含有一个或几个液泡，液泡中充满了液体。液泡的主要作用是转运和储藏养分、水分和代谢副产物或代谢废物，即具有仓库和中转站的作用。除此外，植物细胞中还有线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、圆球体、溶酶体、微管、微丝等细胞器。植物细胞中最重要的部分要数细胞核了，在光学显微镜下，细胞核可明显地分为核膜、核仁和核质三部分。核是遗传物质主要分布中心，同时也是遗传与代谢的控制中心。

人们都知道植物体是由细胞构成的，但这一结论的得出并非那么容易。340多年前，英国皇家科学学会的RobertHooke用荷兰人Leeuwenhoek发明制作的显微镜观察了一小片软木，看到软木是由许多蜂窝状的小格子组成，Hooke将每一个格子称作“细胞”。

1838～1839年，德国植物学家MatthiasSchleiden（施莱登）和动物学家施旺根据对植物和动物观察的大量资料提出：一切动、植物有机体都由细胞组成；每个细胞是相对独立的单位，既有自己的生命，又与其他细胞共同组成整体生命。第一次明确地指出了细胞是有机体结构的基本单位，是生命活动的基本单位，从而建立了细胞学说(celltheory)。恩格斯高度评价了细胞学说，把它与能量守恒和转化定律、生物进化论并列为19世纪自然科学的三大发现。细胞学说为生物科学的发展奠定了坚实的基础。

20世纪初，研制成电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，从而使人们看到了光学显微镜下所看不到的更为精细的结构。20世纪60年代，利用组织培养技术，从植物离体细胞培养成完整的植株，这一事实表明了离体的单细胞具有遗传上的全能性。更进一步证明了细胞是生物体的结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单位，也是生物个体发育和系统发育的基础。

细胞壁分为３个部分

1·.胞间层。
2·.初生壁。
3·次生壁。
液泡(vacuole)
幼小的植物细胞(分生组织细胞)，具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细胞的生长，液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它可占据细胞体积的90％以上。关于去掉植物细胞壁的纤维素酶和果胶酶的试剂。

植物各个器官，如：根、茎卅、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况 　　1．细胞悬浮培养物 　　在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4－ D 2～4mg/L的 MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80～? 120r/min，在 25±1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40rnl新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 　　2．叶肉细胞 　　叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。 
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

一般来说，植物各个器官，如：根、茎卅、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

1．细胞悬浮培养物
在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4－ D 2～4mg/L的 MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80～? 120r/min，在 25±1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40rnl新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。

2．叶肉细胞
叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养? 材料，下列外界因素是考虑的重要因子：
（1）光强为3000～6000lx。
（2）温度为20～25℃培养。
（3）相对湿度在60％～80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。?

3．植物材料的预处理
对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理。预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。

二、酶
1．酶的种类
构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C；，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。

果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。 ZA3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等），果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。

2．渗透稳定剂
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。

因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括 KCL、MgSO4和 KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。

3．酶溶液的pH值
酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当PH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

三、原生质体的分离
分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。

植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加 0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。

酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃ 左右进行酶解。
若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把 4g叶组织置于含有 200ml不加蔗糖和琼脂的培养基 500ml三角瓶中。在 4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。

若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0～6．0），在25～33℃条件下酶解24h。原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。

四、影响原生质体分离的因素
1．酶制剂活力和纯度
粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。Onoznka纤维素酶R－10和离析酶R一10的最适宜pH值分别为5～6和4～5。不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。

2．渗透稳定剂的作用
在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。

五、原生质体的净化和活力测定
在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。

原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸会上清液。
3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104～106／ml。

在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯（FDA）染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出太原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荣光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。

FDA染色测活性的方法如下： 取洗涤过的原生质体悬浮液 0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。

　　组成植物体的细胞的形状和大小是各不相同的，其不同部位的细胞，形状和大小与它们行使的功能密切相关。大多数高等植物细胞的直径通常约在10-200微米之间。植物细胞的大小差异很大，一般必须在显微镜下才能看到。在种子植物中，细胞的直径一般在10～100微米之间，较大细胞的直径也不过是100～200微米。也有少数植物的细胞较大，肉眼可以分辨出来，如番茄果肉、西瓜瓤的细胞，直径可达1 mm；苎麻茎中的纤维细胞，最长可达550 mm；有的细胞极长，如苎麻纤维细胞可长达55cm，最长的细胞十无节乳汁管长达数米至数十米，如橡胶树的乳汁管，但这些细胞在横向直径上仍是很小的。植物细胞的大小是由遗传因素所控制，其中主要是由于细胞核的作用。  植物细胞

　　① 细胞核控制能力的限制。细胞核与细胞质一起进行着细胞中的生长、发育和保持细胞的正常代谢活动，细胞核对于细胞质的影响，在数量上有一定的限制，细胞的大小就受细胞核所能控制范围的制约。 　　② 细胞表面积的限制。生活细胞中，原生质不断地进行着一切代谢活动，并与周围环境(包括相邻的细胞)不断地进行物质交换；同时，进入细胞的物质，在内部也有一个扩散传递问题。细胞体积小，它的相对表面积就大，这对物质的迅速交换和转运都比较有利。此外，细胞的大小受细胞内代谢速率的影响。在自然界中，可以看到，代谢速率快的植物细胞一般都比较小，而较大的细胞活动相对较少。例如，根、茎顶端的分生组织细胞就比储藏的薄壁组织细胞要小得多。 　　植物细胞的形状非常多样，常见的有球形、椭圆形、多面体、纺缍形和柱状体等。 　　植物细胞的形状大小尽管多种多样，但基本结构是一样的。例如一切活细胞都含有原生质和其外面的细胞壁。坚硬的细胞壁保护着原生质体，并且维持着细胞的一定形状，其主要成分是纤维素。细胞壁是植物细胞独有的，动物细胞没有细胞壁。植物细胞还含有质体，是植物细胞生产和储存营养物质的场所。最常见的质体是叶绿体，它是专门进行光合作用的细胞器。动物细胞中不含有质体。大多数植物细胞都含有一个或几个液泡，液泡中充满了液体。液泡的主要作用是转运和储藏养分、水分和代谢副产物或代谢废物，即具有仓库和中转站的作用。除此外，植物细胞中还有线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、圆球体、溶酶体、微管、微丝等细胞器。植物细胞中最重要的部分要数细胞核了，在光学显微镜下，细胞核可明显地分为核膜、核仁和核质三部分。核是遗传物质主要分布中心，同时也是遗传与代谢的控制中心。

　　１.胞间层。 　　２.初生壁。 　　3.次生壁。 　　3 液泡(vacuole) 　　幼小的植物细胞(分生组织细胞)，具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细  植物细胞
胞的生长，液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它可占据细胞体积的90％以上。 　　4关于去掉植物细胞壁的纤维素酶和果胶酶的试剂. 　　要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

通常植物细胞都比较小，形状多种多样。细胞的形状和大小，取决于细胞的遗传性、所担负的生理功能以及对环境的适应性，且伴随着细胞的生长和分化，常相应地发生改变。
 单细胞藻类植物和细菌或分离的单个细胞，因细胞处于游离状态，常为球形或近于球形。多细胞植物体中，细胞是 紧密排列在一起的，由于相互挤压，往往形成不规则的多面体。高等植物体内的细胞，具有精细的分工，其形状极具多样性。例如，输送水分和养料的细胞（导管分子和筛管分子），呈长筒形，并连接成相通的“管道”，以利于物质的运输；起支持作用的细胞（纤维），一般呈长梭形，并聚集成束，加强支持的功能；吸收水、肥的根毛细胞，向外产生一条长管状的突起，增大了它和土壤的接触面积（图1-2）。这些细胞形状的多样性都是细胞形态与其功能相适应的结果。
　　一般讲来，植物细胞的体积很小，多数细胞的直径为10～100μm，肉眼难以辨别。有人认为：细胞体积的大小，主要受细胞核所能控制的范围的制约，体积小，则表面积大，有利于细胞与外界进行物质交换。但不同种类、不同部位的细胞大小差别悬殊。 

　　植物细胞虽然大小不一、形状多样，但其结构基本相同（图1-3）。植物细胞由原生质体（protoplast）和细胞壁  （cell wall）两部分组成。原生质体是由生命物质—原生质（protoplasm）分化而成的结构，是一个细胞内全部生活物质的总称。真核植物细胞的原生质体又可分为细胞膜、细胞质和细胞核三部分；原核植物细胞的原生质体中，没有明显的细胞质和细胞核的分化。细胞壁是包被在原生质体外侧的保护结构，动物细胞不具细胞壁。
（一）原生质体的结构
　　原生质体由细胞膜、细胞质和细胞核三部分组成。
　　1. 细胞膜（cell membrane）
　　细胞膜又称质膜（plasmalemma），是位于原生质体外围、紧贴细胞壁的膜结构。组成质膜的主要物质是蛋白质和脂类，以及少量的多糖、微量的核酸、金属离子和水。在电子显微镜下，用四氧化锇固定的细胞膜具有明显的“暗-明-暗”三条平行的带，其内、外两层暗带由蛋白质分子组成，中间一层明带由双层脂类分子组成，三者的厚度分别约为2.5 nm、3.5 nm和2.5nm，这样的膜称为单位膜（unit membrane）或生物膜（biomembrane）（图1-4）。
　　细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。细胞膜通过  胞饮作用（pinocytosis）、吞噬作用（phagocytosis）或胞吐作用（exocytosis）吸收、消化和外排细胞膜外、内的物质。在细胞识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面，质膜也发挥重要作用。 
　　2. 细胞质（cytoplasm）
　　真核细胞质膜以内、细胞核以外的原生质称为细胞质。细胞质可进一步分为胞基质和细胞器。
　　1）胞基质（cytoplasmic matrix）
　　胞基质或称胞质溶胶（cytosol）、基本细胞质（fundamental cytoplasm）或透明质（hyaloplasm）等，是细胞器代谢的外环境，是除细胞器和后含物以外的、呈均质、半透明、胶网状的液态物质。 
　　2）细胞器（organelle）
　　细胞器是细胞内具有特定的形态、结构和功能的亚细胞结构。活细胞的细胞质内有多种细胞器，包括具有双层膜结构的质体、线粒体，具有单层膜结构的内质网、高尔基体、液泡、溶酶体、圆球体和微体，以及无膜结构的核糖体、微管、微丝等。
　　(1) 质体（plastid）
　　质体是真核植物细胞特有的细胞器，一般有几个至十几个μm。根据质体的发育程度、功能和色素情况，可将其分为前质体、叶绿体、白色体和有色体。
　  　前质体（proplastid） 前质体主要存在于根端、茎端、胚和卵等的幼龄细胞内。前质体一般是无色或呈淡绿色的球状体，直径约为1～1.5μm，其外有双层膜包被，内膜内褶，伸入基质中，或形成少许游离的小泡或类囊体（thylakoid），膜内基质中有少量的DNA、RNA、核糖体和可溶性蛋白等。当细胞生长分化时，前质体可转变成其他类型的质体。
　　叶绿体（chloroplast） 高等植物的叶绿体，主要存在于叶肉细胞内，在茎的皮层细胞、保卫细胞、花萼和未成熟的果实中也有分布，其功能是光合作用（photosynthesis），合成有机物。叶绿体呈透镜形或椭圆形，长径3～10μm，短径2～4μm。细胞内叶绿体的数目、大小和形状因植物种类和细胞类型不同而有很大差异。一个细胞内可能有十多个、几十个、甚至几百个叶绿体，如菠菜的叶肉细胞内，有200～400个叶绿体。在细胞内，叶绿体常分布在靠近质膜处的胞基质中。
 
　　  白色体（1eucoplast） 白色体来自于前质体，是不含可见色素的质体，常见于甘薯、马铃薯等植物的地下贮藏器官、胚以及少数植物叶的表皮细胞中。白色体近于球形，约2～5μm大小，其内部结构简单，在基质中仅有少数不发达的片层（图1-7）。根据白色体的功能及所贮藏的物质不同可将其分为造粉体（amyloplast）、造蛋白体（proteinoplast）和造油体（elaioplast)。造粉体是贮存淀粉的白色体，主要分布于子叶、胚乳、块茎和块根等贮藏组织中，遇碘呈蓝紫色。储藏蛋白质的白色体称为造蛋白体，常见于分生组织、表皮和根冠等细胞中，遇碘呈黄色；贮存脂类物质的白色体为造油体，存在于胞基质中，遇苏丹III呈橙红色。
 
　　有色体（chromoplast） 有色体由前质体发育而来，或由叶绿体失去叶绿素而成，是含有类胡萝卜素，包括黄色  的叶黄素（xanthophyll）和红色的胡萝卜素（carotene）的质体。在不同细胞或同一细胞的不同时期，由于二者含量的比例不同，有色体呈红、黄色之间的种种色彩。有色体可见于部分植物的花瓣、成熟的果实、胡萝卜的贮藏根以及衰老的叶片中。有色体的形状以及内部结构多种多样。大多数植物的花瓣以及柑桔、黄辣椒的果实中的有色体呈球状；黄水仙花瓣、番茄果实中的有色体呈同心圆排列的膜结构；红辣椒果实中呈管状等。有色体赋予花、果实鲜艳的色彩，可吸引昆虫，有利于传粉和果实的传播。
　　(2) 线粒体（mitochondrion）
　　活的真核细胞一般都有线粒体，是细胞内化学能转变成生物能的主要场所。线粒体的形态与细胞类型和生理状况密切有关，常呈球状、杆状、分枝等。线粒体的大小一般为(0.5～1.0)μm×(1～2)μm，有的可达（2～4）μm×（7～14）μm。细胞的种类或细胞的生理活性不同，线粒体的数目亦有差异。一般代谢旺盛的细胞中线粒体数目多，如玉米的一个根冠细胞中，估计有100～3000个线粒体。
 
　　(3) 核糖体（核糖核蛋白体，核蛋白体，ribosome）
　　核糖体是合成蛋白质的细胞器。生长旺盛、代谢活跃的细胞内核糖体多。核糖体主要存在于胞基质中，但在细  胞核、内质网外表面及质体和线粒体的基质中也有分布。核糖体含有大约60%的核糖核酸和40%的蛋白质。胞基质中的核糖体由两个近于半球形、大小不等的亚基结合而成（图1-7），直径约为17～23nm。多个核糖体可结合到一个mRNA链上，形成多聚核糖体（polyribosome）。
　　(4) 内质网(endoplasmic reticulum, ER)
　　内质网是由单层膜围成的扁平的囊、槽、池或管状的、相互沟通的网状系统（图1-9）。ER膜可和核膜的外层膜相连，也可经过胞间连丝和相邻细胞的ER相连，但是不与质膜相连。内质网有两种类型：① 糙面内质网（rough endoplasmic reticulum, rER），其膜的外表面附着有核糖体。② 光面内质网（smooth endoplasmic reticulum, sER），其膜上无核糖体。  
　　内质网具有制造、包装和运输代谢产物的作用。rER能合成蛋白质及一些脂类，并将其运到sER，再由sER形成小泡，运到高尔基体，然后分泌到细胞外（图1-10）。sER还可合成脂类、糖元等。ER特化或分离出的小泡可形成液泡、高尔基体、圆球体及微体等细胞器。有人认为质体、线粒体和细胞核等的外层膜也与ER有关。此外，内质网还有“分室”作用，将许多细胞器相对分隔开，便于各自的代谢顺利进行。
　　(5) 高尔基体（golgi body, dictyosome）
　　高尔基体是由一叠（一般l～8个）扁平、平滑、近圆形的单位膜围成的、直径约1～3μm的多囊结构（cisterna, 或称小池、潴泡、槽库），在生长和分泌旺盛的细胞内特别多（图1-11）。
　　高尔基体是动态的结构，有极性。凸出的一面为形成面（近核面），凹入的一面是成熟面（近质膜面）。高尔基体边缘膨大且具穿孔，或分枝成许多小管，周围有很多由扁囊边缘“出芽”脱落的囊泡，它们可转移到胞基质中，和其他来源的某些小泡融合，也可和质膜结合（图1-10）。  
　　高尔基体的主要功能是合成多糖，参与细胞壁的形成，有时也参与运输ER合成的物质。
　　(6) 液泡（vacuole）
　　  液泡是由具选择通透性的液泡膜（tonoplast）和细胞液组成的细胞器。在不同类型或不同发育时期的细胞中，液泡的数目、大小、形状、成分都有差别。幼期的细胞，如顶端分生组织细胞内，液泡小、数量多，散布于胞基质中。随着细胞的长大和分化，小液泡增大，并逐渐合并为少数几个甚至一个位于细胞中央的大液泡，将其他的原生质都挤成一薄层，包在液泡的外围而紧贴着细胞壁，有利于新陈代谢和细胞的生长（图1-12）。
 
　　液泡的主要生理功能包括：① 调节细胞水势和维持细胞的膨压，液泡吸水膨胀，是植物体保持挺立状态的根本因素；若液泡失水，植株就萎蔫，影响植物生长。② 参与细胞内物质的积累、储藏与转化，控制液泡内的K+、Na+、Ca2+、Cl-、以及磷酸盐、柠檬酸、苹果酸和多种氨基酸等物质的输入和输出，对细胞代谢起着调节和稳定的作用。液泡还储藏糖、脂肪、蛋白质等。③ 防御作用，许多植物液泡中还有几丁质酶，它能分解破坏真菌的细胞壁，当植物体被真菌侵害时，几丁质酶合成增加，对病原体有杀伤作用。
　　(7) 溶酶体（lysosome）和圆球体（spherosome）
　　溶酶体是由单层膜构成的能分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器（图1-13）。溶酶体主要来自于高尔基体和内质网分离的小泡。它的形状和大小差异较大，一般为球形，直径0.2～0.8μm。溶酶体除含特有的酸性磷酸酶外，还有许多（已知的有60多种）其他的水解酶。
 
　　  溶酶体具有异体吞噬（heterophagy）、自体吞噬（autophagy）和自溶作用（autolysis）的功能。溶酶体分解从外界进入到细胞内的物质，称为异体吞噬，例如，有些大分子物质、病毒、细菌，经胞饮或吞噬作用被细胞摄入后，和溶酶体融合而被消化。溶酶体消化细胞自身的局部细胞质或细胞器称为自体吞噬。自溶作用是指在植物发育进程中，有一些细胞会逐步正常地死亡，这是在基因控制下，溶酶体膜破裂，将其中的水解酶释放到细胞内，而引起的细胞自身溶解死亡。自溶作用实际上是一种细胞的程序性死亡（programmed cell death），有利于个体发育。
　　圆球体是由单层膜围成的细胞器。圆球体除含水解酶外，还有脂肪酶，能积累脂肪。圆球体普遍存在于植物细胞中，与脂肪的代谢有关。
　　(8) 微体（microbody）
　　微体是单层膜包围的呈球状或哑铃形的细胞器，其直径约0.2～1.5μm，普遍存在于植物细胞中。植物体内的微体有两种类型：一类是含过氧化氢酶的过氧化物酶体（peroxisome）（图1-14），另一类是含乙醇酸氧化酶的乙醛酸循环体（glyoxysome）。
　  　过氧化物酶体常和叶绿体、线粒体聚集在一起，将光呼吸（photorespiration）的底物乙醇酸氧化为乙醛酸。
　　乙醛酸循环体除存在于油料植物种子的胚乳或子叶细胞外，在大麦、小麦种子的糊粉层以及玉米的盾片细胞内也有存在。在种子萌发过程中，乙醛酸循环体将储存在子叶和胚乳中的脂类物质逐步转化为糖类，满足种子萌发之需。
  
　　(9) 细胞骨架（cytoskeleton）
　　细胞骨架是真核细胞的细胞质内普遍存在的蛋白质纤维网架系统，包括微丝（microfilament, MF）系统、微管（microtubule, MT）系统和中间纤维（intermediate filament,IF）系统。这三类骨架系统分别由不同蛋白质分子以不同方式装配成不同直径的纤维，然后靠许多连接蛋白相互连接形成既有柔韧性又有刚性的三维网架，把分散在细胞质中的细胞器及各种膜结构组织起来，固定在一定的位置，使细胞内新陈代谢有条不紊地进行（图1-15）。细胞骨架系统还是细胞内能量转换的主要场所，微丝系统、微管系统和相关的马达蛋白（motor protein）相互作用，将化学能直接转换为机械能，驱使细胞及细胞内组分的  运动。
　　微丝主要由肌动蛋白（actin）组成直径6～8nm的细丝（图1-16）。肌动蛋白分子近球形，分子量为42kDa，它既可以以溶解的单体G-肌动蛋白（globular actin）存在，又可聚合成纤维状的F-肌动蛋白（fibrous actin）。它们的聚合和解聚与细胞生理状态、细胞内阳离子及ATP等条件有关。微丝参与细胞质流动、染色体运动、叶绿体运动、胞质分裂、物质运输以及与膜有关的一些重要生命活动如内吞作用和外排作用等。
　　微管主要由微管蛋白（tubulin）和少量微管结合蛋白组成（图1-16）。
　　在植物细胞内，微管的主要功能有：①支持和维持细胞的一定形状，例如被子植物的精子细胞呈纺锤形，与细胞质中的微管和细胞长轴相一致地排列有关。用秋水仙素等药剂将微管破坏，精子细胞就变成球形。②参与构成有丝分裂和减数分裂时出现的纺锤丝。③调节细胞壁的生长和分化。④影响胞内物质的运输和胞质运动。⑤构成低等植物的鞭毛，调节整个细胞的运动。
　　  中间纤维又称为中间丝或中等纤维，直径约为10nm，由于其平均直径在微管和微丝之间，故称为中间纤维。中间纤维是由长的、杆状的蛋白质装配的一种坚韧、耐久的蛋白质纤维。一般认为，中间纤维在维持细胞形态、调节胞内颗粒运动、控制细胞器和细胞核定位等方面有重要作用。
　　3. 细胞核(nucleus)
　　细胞核是真核细胞遗传与代谢的控制中心。生活的细胞一般都有一个近于球形的细胞核，因其折光率与细胞质不同，在光学显微镜下容易辨别。
　　细胞核的大小、形状以及在胞内所处的位置，与细胞的年龄、功能以及生理状况有关，而且也受某些外界因素的影响。在胚、根端和茎端的分生组织细胞中，细胞核所占的体积通常较大，约占整个细胞体积的1/3～1/2，直径约为7～10μm。在薄壁组织和其他许多分化成熟的细胞内，细胞核的直径一般为35～50μm，但其相对体积却比年幼细胞小。不过，有少数植物的细胞核很大，如苏铁的卵细胞核，直径可达1mm，肉眼可见；而最小的细胞核，如某些真菌的细胞核，其直径不超过0.5  μm。细胞核的形状，虽然一般是近于球形的，但也有许多不同形状，如禾本科植物的保卫细胞，细胞核呈哑铃形；在一些花粉的营养细胞和感染黑穗病的玉米叶片的上表皮细胞中，细胞核形成许多不规则的裂瓣。细胞核在细胞内所处的位置，因细胞的生长和分化状况而改变。在幼期细胞中，细胞核常位于细胞中央，细胞生长时，由于液泡的增大和合并成中央大液泡，细胞核常被挤至细胞的一侧。
　　一般植物细胞仅具一个细胞核，但花药绒毡层细胞、乳汁管以及许多真菌和藻类植物的细胞中常含有两个或更多的细胞核。分化成熟的筛管分子，其细胞核解体，因而不具细胞核。一般说来没有核的细胞不能长期正常生活。
　　细胞核的结构，随着细胞周期的改变而相应地变化。间期的细胞核可分为核被膜（nuclear membrane）、核仁（nucleolus）和核质（nucleoplasm）三部分（图1-17）。
　　间期细胞核的主要功能是贮存和复制DNA；合成和向细胞质转运RNA。DNA在间期一定阶段（S期即DNA合成期）以半保留方式复制，其含量倍增，为子细胞准备一整套和母细胞相同的遗传物质，通过有丝分裂，分配给子细胞。由此可进一步理解细胞核是细胞的控制中心。rRNA在核仁中合成，并参与核蛋白体亚单位的形成，mRNA和tRNA是以染色质中的DNA为模板合成的，并经核孔转移到细胞质中，参与细胞质中的蛋白质合成。 
3. 核质（nucleoplasm）
　　（二）细胞壁（cell wall）
　　细胞壁是原生质体生命活动过程中向外分泌的多种物质复合而成的结构，为植物细胞所特有。细胞壁支撑和保护植物细胞，与维持原生质体的膨压和植物组织的吸收、蒸腾、运输和分泌等方面的生理活动有很大的关系。多细  胞植物的细胞壁有支持和巩固植物体作用，特别是那些特化为机械组织的细胞的细胞壁。
　　1. 细胞壁的结构分层
　　在细胞发育生长过程中，因其所形成的壁物质在种类、数量、比例以及物理组成上的时空差异，细胞壁结构表现出分层现象（lamellation），在显微镜下可区分为胞间层、初生壁和次生壁（图1-21）。一般认为，分化完成后仍保持有生活的原生质体的细胞，不具次生壁。
　　（1）胞间层（intercellular layer）或中层（middle lamella） 胞间层是新的子细胞形成时产生的、以果胶为主的细胞壁结构。果胶是一类多糖物质，胶粘而柔软，能将相邻的细胞粘在一起，果胶物质的可塑性能缓冲细胞间的挤压又不致阻碍初生壁生长和扩大表面积。胞间层在一些酶（如果胶酶）或酸、碱的作用下会发生分解，使相邻细胞失去  连接，而彼此分离。西瓜、番茄等果实成熟时，部分果肉细胞彼此分离就是这个原因。 
  （2）初生壁（primary wall） 初生壁是细胞生长、体积增大时所形成的壁层，分别位于胞间层两侧。构成初生壁的主要物质有纤维素、半纤维素和果胶物质等。初生壁一般都很薄，厚度约1～3μm，不过也有均匀或局部增厚的，前者如柿胚乳细胞，后者如厚角组织细胞。然而，增厚的初生壁是可逆的，即在一定情况下厚的初生壁又可以变薄，例如柿子胚乳细胞的壁物质在种子萌发时，分解转化，厚壁又变薄；厚角组织在转变成分生组织时，其增厚的壁也能变薄。 
   （3）次生壁（secondary wall） 次生壁是某些细胞在生理上分化成熟、体积停止增大、原生质体走向消失的过程中在初生壁内侧产生的壁层，一般比初生壁厚得多。例如，各种纤维细胞、导管、管胞、石细胞等。构成次生壁的物质以纤维素为主，但还有木质素、角质素、矿质等物质。
　　根据次生壁中纤维素微纤丝的排列方向，可将其进一步地分为内、中、外三层，微纤丝在各层以不同的取向规则地排列，使细胞壁厚度增加，刚性增强，但缺乏延伸性（图1-24）。  

2． 细胞壁的生长
　　3. 纹孔和胞间连丝
　　1） 纹孔（pit）
　　初生壁的厚度往往是不均匀的，常有一些凹陷区域，其内有许多胞间连丝通过，这个区域称为初生纹孔场（pri  mary pit field）（图1-25）。次生壁形成时，有的初生纹孔场所在的位置不形成次生壁，在细胞壁上，只有中层和初生壁隔开，而无次生壁的较薄区域称为纹孔。相邻两细胞的纹孔通常成对存在，合称纹孔对（pit pair）。纹孔对中的胞间层和两边的初生壁，合称纹孔膜（pit membrane）。纹孔的腔，称为纹孔腔（pit cavity）（图1-26）。  
  
　　2）胞间连丝（plasmodesma）
　　胞间连丝是连接相邻两个植物细胞间的细胞质细丝，是细胞间物质、信息和能量交流的直接通道，行使水分、营养物质、小的信号分子以及大分子的胞间运输功能。胞间连丝一般都很细，直径小于0.1μm，经银、汞等重金属特殊处理、使它扩大，可在光学显微镜下分辨出来（图1-27）。 
  高等植物的生活细胞之间，一般都有胞间连丝相连，其数量、分布位置不一。一个分生组织细胞，可能有1000～10000条胞间连丝。细胞的不同侧面，胞间连丝的数量不一，筛管分子和某些传递细胞之间，胞间连丝特别多。
4. 细胞壁的化学组成 
5. 细胞壁在植物细胞生命活动中的作用
　　（三）植物细胞的后含物
　　植物细胞生活过程中，不仅为生长、分化供应营养物质和能量，同时也产生贮藏物质、代谢废物或植物的次生物质等，这些非原生质的物质称为后含物（ergastic substance）。
　　1. 储藏物质
　　叶绿体光合作用的同化物除运往植物体各部位供新陈代谢消耗外，一部分可暂时储存起来，需要时经分解再利用。常见的储藏物质有淀粉、脂类（油和脂肪）和蛋白质。
　　1）淀粉（starch）
　　淀粉是植物细胞的质体中形成的最普遍的储藏物质，储藏淀粉常呈颗粒状，称为淀粉粒（starch grain）（图1-30），主要分布于储藏组织的细胞中。例如，禾本科作物籽粒的胚乳细胞，甘薯、马铃薯、木薯等薯类作物薯块的储藏薄壁组织细胞，都有大量的淀粉粒存在。淀粉遇碘呈蓝紫色，可根据这种特性反应，检验其存在与否。
 
　　不同植物的淀粉粒的大小、形状和脐所在的位置，都各有其特点，可作为商品检验、生药鉴定上的依据之一。
　　2）蛋白质（protein）
　　储藏蛋白质以多种形式存在于细胞质中。例如，在禾本科植物籽粒的糊粉层中，储藏的蛋白质粒称糊粉粒（aleurone grain），形成于液泡之中。蓖麻、油桐胚乳细胞的糊粉粒内，除了无定形的蛋白质外，还含有蛋白质的拟晶体和非蛋白质的球状体（图1-31），花生子叶细胞内，也可见到这样的糊粉粒，但量较少。在马铃薯块茎外围的储藏薄壁组织细胞中，蛋白质的拟晶体和淀粉粒共存于同一细胞内。
　　糊粉粒还含有水解酶。因此，除了是一种蛋白质的储藏结构外，还可以看作是一种被隔离的含有水解酶的溶酶体。储藏蛋白质常呈固体状态，与原生质体中有生命而呈胶体状态的蛋白质性质不同。储藏蛋白质遇碘呈黄色。
 
　　3）油（oil）和脂肪（fat）
　　在植物细胞中，油和脂肪是由造油体合成的重要的储藏物质，二者可能少量地存在于每个细胞内，呈小油滴或固体状，大量地存在于一些油料植物种子或果实内，子叶、花粉等细胞内也可见到。油和脂肪遇苏丹III或苏丹IV呈橙红色。
　　2. 晶体（crystal）和硅质小体（silica body）
　　在植物细胞中的结晶形成于液泡内，常为草酸钙结晶，呈各种形状（图1-32），如印度橡皮树叶的上表皮细胞中的结晶呈钟乳体等，禾本科、莎草科、棕榈科植物茎、叶的表皮细胞内所含的二氧化硅晶体，称为硅质小体。 

　　

　　（1）光强为3000～6000lx。 　　（2）温度为20～25℃培养。 　　（3）相对湿度在60％～80％左右。 　　植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。? 　　3．植物材料的预处理 　　对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应  植物细胞
培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理。预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。

　　构成植物细胞壁的成分 　　①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等； 　　②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右； 　　③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 　　纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C；，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 　　果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。 　　ZA3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等），果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 　　日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。

　　植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 　　因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免  植物细胞
破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括 KCL、MgSO4和 KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。 　　酶溶液的pH值[1] 　　酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当PH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

　　分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 　　酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。 　　植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。 　　由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。 　　酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 　　对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。

　　酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃ 左右进行酶解。 　　若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把 4g叶组织置于含有 200ml不加蔗糖和琼脂的培养基 500ml三角瓶中。在 4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶  植物细胞
液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。 　　若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0～6．0），在25～33℃条件下酶解24h。原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。

　　1．酶制剂活力和纯度 　　粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。Onoznka纤维素酶R－10和离析酶R一10的最适宜pH值分别为5～6和4～5。不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。 　　2．渗透稳定剂的作用 　　在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。

　　在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。 　　步骤 　　1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。 　　2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸会上清液。 　　3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。 　　4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104～106／ml。 　　在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯（FDA）染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出太原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荣光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。 　　FDA染色测活性的方法如下： 取洗涤过的原生质体悬浮液 0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。^[1]

水生植物	沉水植物	攀缘植物	植物睡眠	仙人掌科	植物农药	寄生植物
药用植物	植物血型	胎生植物	植物细胞	植物神经	被子植物	植物克隆
植物检疫	植物肿瘤	盐碱植物	植物修复	植物学名	植物抗性	植物智能
绿化植物	植物害虫	低等植物	草坪植物	植物染料	植物纤维	植物学
植物繁殖	入侵植物	沙漠植物	植物精油	裸子植物	植物宠物	丝袜花

（1）http://mall.sina.com.cn/Product_1547551.htm
（2）http://www.bioon.com/biology/Class422/19742.shtml