愈伤组织

在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。 在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l来诱导植物材料愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。

分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。

外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。

愈伤组织的培养的培养分为继承培养和分化培养。

愈伤组织的继承培养：在外植体上形成以后，愈伤组织的继承培养在已充分发育，但没有出现老化现象之前，应及时从外植体上分离下来，转入继代培养基上进行继代培养。分离是必要的措施，继代培养时若连同外植体就会影响愈伤组织的产量和质量，可能是由于残存的外植体在死亡过程中会产生某些有毒物质，愈伤组织会出现老化、粘化及不正常分化等现象。一般情况下，从外植体上分离的愈伤组织须经过4～6周的培养才能得到充分的发育。为了增殖发育良好的愈伤组织，继代培养是有效的措施。在良好的培养条件下，甘蔗愈伤组织可继代一年以上而不丧失分化能力。

影响甘蔗愈伤组织继代培养的主要因素是激素。为协调继代培养中既要维持愈伤组织增殖生长良好、又要保持愈伤组织的分化能力的矛盾，就必须筛选最佳的激素浓度。有报道指出，2，4－D（2～3mg/L）对保持愈伤组织不分化是有效的，但随继代培养次数的增加，其分化绿苗的能力也随之下降。

愈伤组织的分化培养
甘蔗愈伤组织在除去生长素或降低生长素浓度的培养基上，即能发生器官的再分化。在甘蔗的组织培养中，有些品种的愈伤组织对生长素有较强的吸收和分解能力，甚至在含有一定浓度生长素的诱导或继代培养基上亦能迅速分化成苗。影响甘蔗愈伤组织分化成苗的因素有愈伤组织的质量和大小、培养基、光照等。愈伤组织的大小对分化具有明显的影响，接种时愈伤组织块不宜小于5mm。

光照对甘蔗愈伤组织分化绿苗具有较好的促进作用，在无光照条件下分化出的是黄化苗，见光后又会返绿。一般在采光条件好的培养室，用自然散射光就可满足要求。在采光差条件的培养室则需加人工辅助光，通常用日光灯为辅助光源，光照强度1500～2000Lx，光照时间12小时。至于培养基对分化的影响，则认为适宜的生长素与细胞分裂素配比有利于甘蔗愈伤组织的绿苗分化。甘蔗不同品种、不同材料愈伤组织的分化所要求的最佳激素配比不同，常用的分化培养基是“MS＋NAA（0.5～1.5mg/L）+BA(0.5～1.0mg/L)”，也有同时使用IBA（0.5～2.0mg/L）的。

组织培养过程中的酚污染会影响培养效果。酚污染程度与外植体细胞的多酚氧化酶活性有关。甘蔗茎尖、嫩茎切段及靠近节处的幼嫩叶鞘均有较高的多酚氧化酶活性，所以这些组织的外植体接种后的酚污染也严重。培养基中添加的细胞分裂素物质有提高多酚氧化酶活性的作用，培养过程中的酚污染程度常随细胞分裂素浓度的提高而加重。在培养基中使用0.1~0.5％的活性碳，有减轻酚污染的作用，也有助于根的形成。 在离体培养中，接受各种因素的作用，细胞都会分裂进人脱分化，经持续分裂增生成细胞团，进一步发展成为不受亲本植株影响的愈伤组织。愈伤组织培养作为一种最常培养形式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终都要愈伤组织才能产生再生植株，而且，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的。因此，愈伤组织培养具有多种用途。一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。 一种利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，通过在特定条件下对海膜进行诱导，使之产生丝状的愈伤组织。分离这种愈伤组织，根据实验掌握了光照、温度、营养盐等条件对这种愈伤组织的影响，从而实现了愈伤组织的继代培养和保存。对这种愈伤组织进行悬浮培养，使之快速扩增，产生大量愈伤组织。将悬浮培养的愈伤组织喷洒在附着基上，静水培养使其附着后改为流水培养，并改变培养条件诱导其再生成苗。这种方法可以作为一种有效可行的海膜的育苗方法。应用本发明，可以不受海膜成熟时间限制随时为生产提供种苗，并且由于愈伤组织再生苗不经过有性生殖，因此不会产生性状分离，有利于良种品质的选育。^[1]