)基因效价
大肠杆菌（E.coli）是一种引起人体致病的条件致病菌，属原核微生物。该菌主要来源于人畜的大肠中，通过粪便排出体外，随着环境的变化，发生变异形成一个群落，称为大肠菌群。这类菌在37℃培养条件下培养24～48小时后能发酵半乳糖，产酸、产气，是需氧或兼性厌氧的革
兰氏染色阴性无芽孢杆菌。在人类生活中，以此类菌作为粪便污染指标菌来评价生活饮用水及食品的卫生质量。
噬菌体寄生于大肠杆菌体内，利用大肠杆菌体内的营养物质合成自身，大肠杆菌被裂解而死亡，噬菌体释放出来，再感染其它大肠杆菌，周
而复始，故大肠杆菌的克星是噬菌体（E.coliQT），只要有E.coliQT存在于环境中,大肠杆菌基本消失。
一、实验目的
（一）观察大肠杆菌噬菌体形成噬菌斑的形态；
（二）了解QT效价的测定方法；
（三）熟悉转导实验的操作方法。
二、实验原理
噬菌体分为两种类型，一类为烈性噬菌体，一类为温和性噬菌体（也称为溶原性噬菌体）。噬菌体对宿主细胞的侵染具有高度的特异性，感染了烈性噬菌体的宿主细胞，烈性噬菌体通过复制、装配、成熟后要从宿主细胞中释放出来，而溶原性噬菌体的溶原性细胞经紫外线诱导而裂解出来，在摊布有敏感菌株的琼脂平板培养基上出现肉眼可见的噬菌斑。不同的噬菌体形成噬菌斑的大小形状有差异，同一噬菌体所形成的噬菌斑形状大小基本一致。
不同稀释度的噬菌体裂解液在双层琼脂平板培养基上所形成的噬菌斑的数目不同，通过计算噬菌斑数目可测定噬菌体的效价。
转导是以温和性噬菌体为媒介，将供体细胞的遗传物质转移到受体细胞中去。当用大肠杆菌双重溶原菌E.coliK12F2（λ/λgal+）作为供体菌时，可用紫外线进行诱导使其裂解，裂解后的温和性噬菌体带有大量的gal+基因的转导颗粒，这些遗传物质可转移给不带有gal-基因，不能发酵半乳糖的受体菌——E.coliK12F2gal-，使其获得gal+基因而能发酵半乳糖，可以在EMB琼脂平板培养基上生成紫黑色带金属光泽的菌落，证明转导己成功。
三、实验材料
（一）菌种
供体菌：E.coliK12F2gal+——带有原噬菌体（λ）和缺陷型噬菌体（λgal）能发酵半乳糖。
受体菌：E.coliK12F2gal-——不带噬菌体不发酵半乳糖，对（λ）噬菌体敏感。
（二）培养基的制备
1、缓冲葡萄糖肉汤培养基：蛋白胨10g；Na2HPO42g；葡萄糖1g；NaCl3g；肉浸液1000ml（或用0.5%的牛肉膏代替）。
制法：称各药于肉浸液中，加热溶解，调PH值至7.4分装，于121.1℃条件下进行高压蒸汽灭菌20分钟。
2、缓冲葡萄糖肉汤固体培养基：按“缓冲葡萄糖肉汤培养基”的各成分配制，再按配制量加入20%的琼脂即可。制作方法与“缓冲葡萄糖肉汤培养基”相同。
3、双倍缓冲葡萄糖肉汤培养基：按“缓冲葡萄糖肉汤培养基”各成分的二倍配制，肉浸液仍为1000ml。制作方法与“缓冲葡萄糖肉汤培养基”相同。
4、半乳糖EMB琼脂平板培养基：蛋白胨10g；K2HPO42g；半乳糖10g；琼脂20g；2%伊红液20ml；0.65%美蓝液10ml；水1000ml。制法：将蛋白胨、K2HPO4、半乳糖加热溶解于水中，调PH值至7.6，再加入琼脂，熔化，于121.1℃高压蒸汽灭菌15分钟。
将伊红和美蓝液在沸水浴中灭菌20～30分钟，先按量将伊红液加入己溶化的培养基，摇匀后，再加入美蓝，再摇匀，立即倒平板，在桌面上轻磨，直到该培养基铺满整个平皿底部，放置冷却即可。
5、半固体普通营养琼脂培养基：蛋白胨10g；牛肉膏3g；NaCl5g；琼脂15g；H2O1000ml。制法：除琼脂外，称各药于1/3的水中，加热溶解后，再加足所需水量，调PH值7.4～7.6，煮沸后加入琼脂，待琼脂完全溶化后，分装。以121.1℃高压蒸汽灭菌15分钟即可。
（三）其它
1、含镁离子的磷酸缓冲液：KH2PO42g；K2HPO47g；MgS04.7H200.25g；H201000ml。
2、氯仿。3、培养皿：7.5cm1套；9cm6套。4、试管20支。5、离心管4支（其中一支配换皮塞）。6、移液管：5ml：5支；1ml：20支；10ml：2支。7、三角瓶：100ml：2个；250ml：3个。8、平头玻璃勺1支。9、滴管1支。10、离心机。
四、操作方法
（一）噬菌体（λ）裂解液的制备
1、用无菌操作方法从供体菌（E.coliK12F2gal+）斜面试管中挑取一接种环供体菌接种于2ml缓冲葡萄糖肉汤培养基中，放置于37℃恒温培养箱中培养18小时。
2、18小时后取出，用移液管以无菌的操作方式取1ml供体菌液于9ml缓冲葡萄糖肉汤培养基中，于37℃恒温培养箱中继续培养6小时。
3、6小时后取出，将9ml缓冲葡萄糖肉汤培养基移入离心管放于离心机内，离心5分钟（3000转/分），弃去上清液，剩下沉淀备用。
4、用移液管向沉淀中加入3ml含镁离子的磷酸缓冲液重新制成悬浮液，混合均匀后，取出其悬浮液2ml放入直径为7.5cm的培养皿中，在红光中放于20W的紫外线灯下，距离50cm打开皿盖照射10分钟，立即加入冷却至45℃左右的双倍缓冲葡萄糖肉汤培养基2ml，用黑布包好，放于37℃恒温培养箱内避光培养3小时。
5、3小时后，取出该培养物，用移液管移入带有棉花塞的离心管中，加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡半小时，静止5分钟。于离心机内离心10分钟（3000转/分），将上清液用移液管移入无菌试管中，此液即为噬菌体（λ）裂解液。
（二）噬菌体效价的测定
1、用无菌操作方法从受体菌E.coliK12F2gal-斜面试管内挑取一接种环受体菌于2ml缓冲葡萄糖肉汤培养基中，于37℃恒温培养箱内培养18小时后，用移液管吸取1ml培养液加入9ml缓冲葡萄糖肉汤培养基内，于37℃恒温培养箱内培养6小时。
2、用缓冲葡萄糖肉汤培养基以五倍递增稀释法将上述所制的噬菌体（λ）裂解液进行稀释。
3、用直径为9cm的无菌平皿5套，每套平皿倒入10ml普通营养琼脂培养基作为底层培养基。
4、取5支装有4ml普通营养琼脂培养基的试管，融化后放入50℃左右的水浴中保温，然后向每支试管中加入各稀释度的缓冲葡萄糖肉汤液体培养基培养的E.coliK12F2gal+培养液0.5ml，和缓冲葡萄糖肉汤液体培养基培养的E.coliK12F2gal-培养液0.3ml，摇匀，分别倒入底层己凝固的普通营养琼脂培养基平皿内作上层，在桌面上轻磨摇匀，待冷却凝固后，在平皿上用玻璃铅笔标明稀释度，置于37℃恒温箱中培养18～24小时。
5、经培养后，在出现单个噬菌斑的平板上，用接种针在适度的噬菌斑上刺一下，接种于含有E.coli的缓冲葡萄糖肉汤固体培养基的平板中，置于恒温箱中培养18~24小时，反复进行，直到平板上出现的噬菌斑的形态大小一致，则QT的效价测定成功。
五、噬菌体效价测定结果如下：
QT稀释度10-110-210-310-410-5对照平板
QT数目43039231518698无
QT效价（数/ml）43×101139×101032×10919×10810×107
六、点滴法转导实验
1、取已制好的EMB琼脂平板培养基3个，在平皿底部用玻璃铅笔画线，并标记。
噬菌体（λ）裂解液
↓
←菌带
2、用移液管取E.coliK12F2gal-1ml放入EMB琼脂平板培养基内，用玻璃涂布棒在EMB琼脂平板培养基上按画好的线涂出一条菌带，放入37℃恒温培养箱内培养6小时。
3、将培养6小时后的带菌EMB琼脂平板培养基取出，用接种环沾取噬菌体（λ）裂解液，在菌带的两个方格处和方格外各滴接一环，点滴完毕，将EMB琼脂平板培养基放于37℃恒温培养箱培养48小时，观察结果。
4、将接有噬菌体（λ）裂解液的EMB琼脂平板培养基取出，进行观察，在EMB琼脂平板培养基的菌带上出现了数个呈紫黑色带金属光泽的菌落。由此证明，受体菌E.coliK12F2gal-己接受了供体菌E.coliK12F2gal+的DNA片段（基因），能产生分解乳糖的酶，故能分解乳糖。因此，在EMB琼脂平板培养基上出现紫黑色带金属光泽的菌落（该实验通过多次进行，终于取得成功）。
其失败的原因有以下几点，可作参考：
（1）在噬菌斑的测定中，培养24小时后，无任何菌生长，继续培养至48小时后观察，有极少数菌落生长，但无噬菌斑出现，其原因可从两个方面探讨：原因一，E.coliK12F2gal+在离心时，由于离心时间较短（原为3分钟，后为5分钟）而未沉淀下去，肉眼观察到离心底部的沉淀很可能是缓冲葡萄糖肉汤培养基中的其它杂质。故无噬菌体；原因二，E.coliK12F2gal+培养物在进行紫外线照射诱导后，再加氯仿后振荡不充分，而未能使供体菌内的噬菌体裂解出来，故无噬菌斑。
（2）在DNA的转导实验中，菌带上有菌落且生长良好，但未见紫黑色带金属光泽的菌落出现，由此证明，受体菌E.coliK12F2gal-未能接受到供体菌E.coliK12F2gal+的DNA的片断（基因），由于无分解乳糖的基因，就不能产生分解乳糖的酶，因而就不能利用乳糖，故未出现紫黑色带金属光泽的菌落。
